Efecto de la capsaicina sobre la
proliferación y ciclo celular de
fibroblastos pulpares humanos

Key words: cell cycle, capsaicin, human pulp fibroblast.

La respuesta inflamatoria del tejido pulpar es de origen neurogénico. La regulación del volumen en este tejido que se encuentra rodeado por paredes rígidas es difícil especialmente durante situaciones patológicas donde hay edema. Este tejido tiene un bajo nivel de adaptabilidad, de hecho, cuando la homeostasis se rompe, el tejido sufre procesos inflamatorios irreversibles o necrosis (1).

Aunque existe poca evidencia de la presencia de receptores para la capsaicina en tipos celulares diferentes a las neuronas, muchos estudios han mostrado la acción directa de este vanilloide sobre sinoviocitos, fibroblastos y células tumorales. Dentro de las acciones reportadas están incluidas la apoptosis, diferenciación y proliferación celular, producción de colagenasa y prostaglandina E2 (5, 8, 9, 10).

Durante las etapas iniciales de la inflamación neurogénica pulpar, ante diferentes injurias que entre otras, incluye a los procesos cariosos y de tallado agresivo, en los cuales la dentina queda expuesta, es posible pensar que aprovechando su permeabilidad, la aplicación tópica de la capsaicina permitiría el control de la inflamación de la pulpa. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el efecto de este fármaco sobre otros tipos de células que conforman el tejido pulpar.

El Medio Modificado de Eagle (MEM), el Ac anti-vimentina humana (Isotipo IgM), el Ac anti-ratón IgM-FITC, la penicilina/estreptomicina y la capsaicina (8 methyl-N-vanillyl-6-nonenamide) fueron obtenidos de SIGMA (Saint Louis, MO). El Suero Fetal Bovino (SFB) y la Tripsina/EDTA fueron obtenidos de GIBCO BRL (Life Technologies, Grand Island NY). El Ac anti CD14 humano conjugado con PE y el CycleTEST TM PLUS DNA Kit fueron obtenidos de Becton Dickinson (San Jose, CA).

La pulpa dental humana, fue obtenida de un donante, previo consentimiento informado. Se decidió usar cultivos originados de tejido de un solo donante, debido a la variabilidad descrita dependiendo del origen del tejido (11). Dos terceros molares fueron extraídos e inmediatamente colocados en el MEM suplementado con SFB al 10%, y antibióticos (medio completo). La pulpa fue cortada en pequeñas piezas y los explantes fueron colocados en frascos de cultivo de 25 cc y se esperaron 20 minutos para esperar que se adhirieran, para finalmente añadir 4 mL de medio completo. Los cultivos fueron incubados a 37 oC con 5% CO2 . El desprendimiento de las células, y los pases se logró usando tripsina al 0.25% y EDTA 1 mM. Todos los experimentos se hicieron con FPH en quinto pase.

Los Fibroblastos Pulpares Humanos (FPH), fueron monitoreados usando microscopia de luz. Después del cuarto pase se caracterizaron usando un marcador citoplasmático (vimentina) y uno de superficie (CD14). Para la marcación citoplasmática, se utilizaron en total 1x105 células que se colocaron en un tubo de citometría para ser fijadas con PBS 1x pH 7.4 con paraformaldehído al 1%. Después se lavaron con PBS 1x , SFB al 1% , NaNO3 al 0.1%, las células fueron permeabilizadas con PBS 1x y saponina al 1%. Entonces se agregaron e incubaron en la oscuridad y por separado durante 30 minutos a temperatura ambiente, 10 ml de Ac anti-vimentina y 10 ml de una dilución 1/40 del Ac anti-ratón IgM FITC. Para el análisis del marcador de superficie se agregaron 5 ml del Ac anti-CD14 PE a 1x105 células y se incubó de la misma forma en que se describió anteriormente. Como control negativo para la vimentina, se usaron FPH permeabilizados e incubados con el anticuerpo secundario y para el CD14 se usó un control de isotipo conjugado con PE. Las células fueron lavadas y adquiridas en un FCAScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) y analizadas usando el software Cell Quest.

Para la proliferación y el análisis de ciclo celular se sembraron 2x104 FPH en placas de 24 pozos con 1.0 mL de medio completo. Las células fueron incubadas durante 3 ó 5 días a 37o C y 5% CO2. Las dosis utilizadas partieron de una solución de capsaicina 0.01 M diluida en etanol al 10%. Las diluciones finales se obtuvieron agregando medio completo hasta obtener concentraciones de 10-4 M, 10-8 M y 10-16 M, que a su vez corresponden a concentraciones finales de etanol al 0.1%, 0.05% y 0.025%, respectivamente. Como controles negativos se cultivaron células con medio completo sin capsaicina y medio completo con etanol al 0.1% . Todos los experimentos se hicieron por duplicado. Para recoger las células a las 24, 48, 72 y 96 horas, se agregaron 200 mL de Trypsina/EDTA a cada pozo y se incubaron por 5 minutos, la reacción de la enzima fue neutralizada con 1.0 mL de medio completo, finalmente las células fueron lavadas con PBS 1X y SFB al 1%. Los FPH fueron contados en cámara de Newbauer usando trypan azul. Las células, además fueron marcadas con yoduro de propidio (PI).